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病理组织包埋

更新时间:2021-12-21

简要描述:

病理组织包埋染色之所以成为细胞染色常用的方法是因为HE染色法过程中除化学反应外,还有物理作用中吸附、吸收效果,使HE染色提供良好的核浆对比染色效果。

  病理组织包埋染色俗称HE 染色法为苏木精-伊红染色法,是石蜡切片技术里常用的染色法之一,也是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中基础、广泛的技术方法。


  属性为碱性的苏木素染色液可以使细胞着蓝色,为酸性的伊红使细胞着红色,其结果胞核呈蓝色,胞浆呈红色。两种不同的染色液使细胞通过颜色来改变折光率,在光镜下呈现出细胞图像。


  病理组织包埋染色之所以成为细胞染色常用的方法是因为HE染色法过程中除化学反应外,还有物理作用中吸附、吸收效果,使HE染色提供良好的核浆对比染色效果。


  病理组织包埋染色实验步骤
  1、样品制备:对于贴壁生长细胞,胰酶消化,调整细胞浓度约1×105/ml,滴加于盖玻片上(置于6孔板中),培养相应时间后,取出细胞爬片,用PBS洗涤3次。
  2、样品固定:95%乙醇固定20min,PBS洗涤2次,每次1min。
  3、染核:苏木素染液染色2-3min,自来水洗涤。
  4、分色:镜下观察,若细胞核染色过深,用1%盐酸酒精溶液分色数秒,自来水洗涤。
  5、染胞质:浸入伊红染液染色1min,自来水洗涤。
  6、吹干或自然晾干细胞爬片后,中性树胶封片。

  若细胞用4%多聚甲醛固定,则染色时间相应延长,苏木素染色12-15min,伊红5min即可。


  病理组织包埋染色实验相关用品
  1、固定液:常用95%乙醇和冰丙酮
  2、苏木精染液:称取苏木精粉0.5g,铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中,然后取NaIO 31g,水5ml,再加入甘油30ml和冰醋酸2ml,混合均匀,滤纸过滤,备用。
  3、伊红染液:称取0.5g   伊红染液,溶于100ml蒸馏水中。
  4、稀盐酸乙醇溶液:用75%乙醇配制1%盐酸。
  5、系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。

  6、培养瓶、培养皿、镊子、盖玻片、载玻片、显微镜。


  病理组织包埋染色实验结果:
  细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色,软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色,粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性液体呈粉红色。着况与组织或细胞的种类有关,也随其生活周期及病理变化而改变。例如,细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱,当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时,伊红着色由浅变深。

  病理组织包埋染色常见规格为310ml和3100lm。


  一、常规病理组织包埋染色/HE染色步骤
  1、石蜡切片脱蜡复水:
  (1)二甲苯(Ⅰ) 15min
  (2) 二甲苯(Ⅱ) 15 min
  (3)二甲苯:无水乙醇=1:1 2min
  (4) 100%乙醇(Ⅰ) 5min
  (5) 100%乙醇(Ⅱ) 5 min
  (6) 80%乙醇 5min
  (7) 蒸馏水 5 min

 

     2、苏木精溶液染色:

  (1) 苏木精溶液染色 5 min
  (2) 水洗10 min 或流水冲洗5 min返蓝
  (3) 1%盐酸乙醇 30s分化
  (4) 水洗 30 s

  (5)蒸馏水过洗 5 s 


  3、伊红液染色
  (1) 0.5%伊红液染色 1-3 min

  (2) 蒸馏水稍洗 30 s


  4、病理组织包埋染色脱水封片
  (1) 80%乙醇稍洗 30 s
  (2) 95%乙醇(Ⅰ)1 min
  (3) 95%乙醇(Ⅱ) 1 min
  (4) 无水乙醇 (Ⅰ)3 min
  (5)无水乙醇(Ⅱ)3 min
  (6)二甲苯(Ⅰ) 3 min
  (7)二甲苯(Ⅱ) 3 min

  (8)中性树胶封固


  二、病理组织包埋染色/HE染色结果的判断
  1、实验结果
  细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色,软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色,粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性液体呈粉红色。

  着色深浅与组织或细胞的种类有关,也随其生活周期及病理变化而改变。例如,细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱,当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时,伊红着色由浅变深。


  2、病理组织包埋染色/HE染色评定标准:
  (1)切片完整,厚度4-6微米,厚薄均匀,无皱褶无刀痕;
  (2)染色核浆分明,红蓝适度,透明洁净,封裱美观。

  

病理组织包埋染色全组织包埋免疫荧光染色

  (一)取材及组织处理

  另取5只小鼠经水合氯醛麻醉后,建立跨区耳瓣模型,方法同前。在建模后第3天处死小鼠,脱毛液尽量去除小鼠耳部毛发,将耳瓣侧耳部剪下,利用生理盐水洗净,在光学放大体式显微镜下使用剪刀和镊子进一步去除毛发。接着按照以下步骤进行组织处理:(1)将剪下的小鼠耳放入装有甲醇的EP管中,沉至管底,-20 ℃保存至少30 min;(2)取出鼠耳,放入装有Hanks平衡盐液的培养皿中,在体式显微镜下利用镊子缓慢分离,将耳组织分为前层皮肤、软骨及后层皮肤,将分离出的前层皮肤放入装有4%的多聚甲醛的EP管中,4 ℃固定1 h直至组织沉淀至管底;(3)取出前层皮肤,放入1×PBS中洗涤3次,每次5 min;(4)取出洗涤后的前层皮肤,置于装有1×PBS缓冲液的培养皿中,在光学放大体式显微镜下使用剪刀和镊子剔除多余的脂肪结缔组织,进行精修。


  (二)全组织包埋免疫荧光染色

  对建立跨区耳瓣模型第3 d的鼠耳进行全组织包埋免疫荧光染色,观察跨区耳瓣模型建立3 d后,跨区耳瓣choke区域小血管及毛细血管的管径大小,末梢神经走行以及与血管再生相关的单核巨噬细胞[4]分布情况。CD31与α-SMA抗体分别对血管内皮与血管平滑肌进行染色,利用Tuj1及α-SMA对轴突与血管分别进行标志,利用CD68抗体进行单核巨噬细胞染色。具体操作步骤如下:(1)制备封闭液(简称10%HIGS),将10 ml山羊血清、0.2 ml曲拉通X-100溶于100 ml磷酸盐缓冲液中,并应用0.45 μm的滤器对配成的溶液进行滤过。(2)在室温条件下,将处理完的鼠耳前层皮肤放入装有1 ml 10% HISG的24孔板中,摇床辅助孵育30 min。(3)制备一抗溶液,使用10%HIGS稀释一抗,稀释比例1∶500。将CD31、CD68、α-SMA、Tuj1一抗同时稀释混合使用,孵育时间较长时可加入0.2%抑菌防腐。(4)将经孵育的皮肤取出放入新孔或用滴管吸除10%HIGS溶液后,加入150 μm一抗溶液,4 ℃摇床孵育过夜,第2天将皮肤转移至新孔洞或用滴管吸除原有溶液,加入1 ml 2%HIGS溶液,室温下摇床洗脱一抗3次,每次15 min,每次洗脱更换液体。(5)制备二抗溶液,使用10%HIGS稀释二抗,稀释比例1∶500,将CD31、CD68、α-SMA、Tuj1二抗同时稀释混合使用,通过0.22 μm的生物滤膜对配成的液体进行过滤。13 000 g离心二抗溶液,离心5 min。(6)将洗脱后的皮肤取出,放入新孔洞或用滴管吸除原有溶液,加入150 μm二抗溶液,室温下摇床孵育1 h,避光。(7)取出皮肤,将皮肤转移至新孔洞,加入1 ml 2%HIGS溶液。室温下,摇床洗脱二抗3次,每次15 min,每次洗脱更换液体。(8)取出皮肤,转移至新孔洞,加入150 μm DAPI (1∶1000) 溶液染色,孵育10 min。(9)取出皮肤,转移至新孔洞,加入1 ml 2%HIGS溶液。室温下,摇床洗脱3次,每次15 min,每次洗脱更换液体。(10)把组织样本放入载玻片上铺平,滴加1滴荧光封片剂,封盖盖玻片,放于室温过夜,待荧光封片剂凝固,于共聚焦激光显微镜下扫描观察。




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