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单细胞蛋白质组学服务

更新时间:2024-05-28

简要描述:

单细胞蛋白质组学服务内蛋白质种类繁多,丰度低,动态分布范围宽且无法扩增,因此对检测手段提出了更高的灵敏度要求。在众多高灵敏分析方法中,荧光检测方法的灵敏度可以达到单分子水平,并且具有动态跟踪能力,但是其蛋白质检测通量有限。

  单细胞蛋白质组学服务原理主要基于高灵敏度的蛋白质分析技术,旨在研究单个细胞内的蛋白质组成和功能。这种技术能够揭示细胞间的差异性和多样性,为理解细胞的生理、病理过程提供深入的信息。服务流程通常包括单细胞样品的采集与制备、蛋白质的提取与消化、以及后续的质谱分析等关键步骤。通过这些步骤,可以精确地鉴定和定量单个细胞中的蛋白质,从而揭示蛋白质在不同细胞类型或状态下的表达模式和功能。

  应用范围

  单细胞蛋白质组学的应用范围非常广泛,主要体现在以下几个方面:

  细胞类型鉴定和分类:通过分析单个细胞的蛋白质表达模式,可以准确识别和分类不同的细胞类型,揭示细胞间的多样性和差异性。

  疾病研究:在疾病研究中,单细胞蛋白质组学可以揭示疾病发生发展的分子机制。例如,在癌症研究中,它可以揭示癌细胞的异质性和细胞亚群的存在;在免疫系统疾病和神经系统疾病研究中,它也能提供深入的蛋白质组学信息,有助于发现新的治疗靶点。

  步骤

  单细胞蛋白质组学的主要步骤包括:

  单细胞样品制备:这是单细胞蛋白质组学的第一步,也是关键步骤之一。常用的方法包括微操作、流式细胞分选和单细胞捕获技术等,以确保获取纯净的单细胞样品。

  蛋白质提取和消化:从单个细胞中提取蛋白质,并通过蛋白酶将其消化成肽段,以便进行后续的质谱分析。

  质谱分析:利用质谱仪对消化后的肽段进行定性和定量分析,从而得到单个细胞的蛋白质组信息。

  分析方法

  在单细胞蛋白质组学中,主要的分析方法包括:

  定性分析:通过质谱数据鉴定蛋白质的种类和序列信息。

  定量分析:利用质谱信号的强度等信息,对蛋白质进行定量分析,比较不同细胞或不同状态下的蛋白质表达差异。

  生物信息学分析:对获取的蛋白质组数据进行深入挖掘和分析,包括蛋白质功能注释、代谢通路分析、蛋白质相互作用网络构建等,以揭示蛋白质在细胞中的功能和调控机制。

  单细胞蛋白质组学服务通过高精度的蛋白质分析技术,为我们提供了深入研究单个细胞内蛋白质组成和功能的强大工具。它在细胞类型鉴定、疾病研究等领域具有广泛的应用前景,有望为未来的生物医学研究带来革命性的突破。

  单细胞蛋白质组学服务内蛋白质种类繁多,丰度低,动态分布范围宽且无法扩增,因此对检测手段提出了更高的灵敏度要求。在众多高灵敏分析方法中,荧光检测方法的灵敏度可以达到单分子水平,并且具有动态跟踪能力,但是其蛋白质检测通量有限。然而电化学检测方法虽然细胞干扰小,但受限于蛋白质通量以及电化学活性的要求,无法对多种蛋白质进行同时检测。质谱作为研究蛋白质组学的一种常规方法,其灵敏度高,通过已有的蛋白质数据库,可以同时对上万种蛋白质进行定性以及定量,并且可以提供丰富的蛋白质结构信息。但是由于单个体细胞内的蛋白质总量平均只有约100pg,利用质谱直接进行检测会面临样本复杂度和单细胞灵敏度等挑战,因此质谱前的分离技术对于提高方法检测灵敏度以及蛋白质定性定量的准确度来说十分必要。
  将蛋白组学和转录组学分析整合到单一的多组学方法中提供了在单个细胞中检测RNA表达和蛋白质丰度的动力学可能性,这反过来可能产生对复杂调控过程的机制性见解,例如表观基因组、转录和转录后基因监管。此外,同步的mRNA和蛋白质分析可用于确定mRNA和蛋白质水平在活跃的转录后调控期间相关性较差的细胞状态。
  单细胞蛋白质组学服务工作流程
  单细胞流程当然也是从样本处理开始。对样本进行处理,使细胞分开和悬浮,然后通过荧光活化细胞分选(FACS)进行分离。单个细胞被分配到微量滴定板的各个孔中或芯片型分析系统上,在那里进行裂解。干扰质谱分析的裂解剂需要除去,但由于纯化会导致样本损失,因此研究人员尽量避免使用。
  FACS是细胞分选的shou选方法,但也存在缺点。损失率高(有时非常高),需要训练有素的操作人员,而且购买和操作成本都很高。
  当然,损失并不仅仅发生在细胞分选阶段。“粘稠的蛋白质很难通过液相色谱(LC)分离,因此这个步骤也会造成损失。这将会进一步造成灵敏度问题或分析偏倚。有时,您只是无法从单个细胞的蛋白质中产生足够的离子。”
  为了解决这些灵敏度问题,一些操作方案将未标记的载体蛋白添加到混合物中,以缓解小样本量带来的损失。虽然这些方法有点用,但仍需要质谱技术的进步,特别是在电离效率方面的进步,才能处理小的样本量和体积。
  “如果没有自动化液体处理系统,这些工作流程将无法实现,自动化系统带来了准确的纳升级流体操作,以及一致性和稳定性。”
  早期对单细胞蛋白质组学的尝试使用了基质辅助激光解吸电离(MALDI),这是一种软电离技术,可以保留不稳定的分子特征,并最大限度减少样本损失和样本制备步骤。
  基于MALDI的方法是在上世纪90年代使用的。人们采用MALDI作为离子源,并用飞行时间(TOF)作为质量分析器,从而提供一种功能性的单细胞分析。不过,这些技术存在三个主要缺点:MALDI不能在时域内分离肽段,无法对大量蛋白质进行测序,而且MALDI电离的可变性会影响定量的准确性。
  另一种电离蛋白质的方法,电喷雾电离(ESI),则更容易实现测序,因为它很容易与各种分离方法(如毛细管电泳)相结合。然而,ESI需要大量的样本制备,这可能导致损失,让人们无法接受。
  直接的分析蛋白质水平和RNA表达的方法是使用单个细胞的索引FAC同时测量同一细胞中的少量蛋白质和相应转录物的水平。另一种方法依赖于邻近延伸分析(PEA)与RNA分析并行进行蛋白检测。
  邻近连接分析(PLA)依赖于两个抗体结合的寡核苷酸在同一蛋白质靶点上的连接而不是杂交。这种方法被用来研究蛋白质-蛋白质相互作用的亚细胞定位,例如RNA的PLA在mass-cytometry工作流程中实现,以便能够同时定量单个原代人类外周血单个核细胞中的10个转录物和相应蛋白质。
  通过测序、RNA表达以及蛋白测序分析对转录组和表位进行细胞索引的两种方法利用与DNA条形码结合的抗体,以便能够在单细胞水平上同时分析细胞表面蛋白质和mRNAs。CyTOF与单细胞RNA测序相结合可以追踪树突状细胞(DC)谱系的发育。
  可以想象,将单细胞蛋白组学方法与多组学工具相结合,可以促进我们对细胞过程的理解,特别是对癌症抵抗机制和治疗反应多样性的理解。
  实现单个细胞蛋白质组成的定性定量分析,揭示细胞个体之间的精细差异
  二代测序技术的持续发展使对单细胞基因组和转录组的研究突飞猛进,科学家们对细胞认识的分辨率大大提高,然而单细胞的基因组和转录组数据对描述细胞在生物体复杂环境中的表型和功能还远远不够,而蛋白质作为细胞内所有功能的直接执行者,细胞通过蛋白质及其翻译后修饰,可以感知并响应几乎所有外在和内在的刺激,从而影响整个生命体的功能和状态。
  因此,对单细胞蛋白质组的定性和定量分析,是揭示细胞类型及其状态的工具,在肿瘤异质性、干细胞分化、生殖细胞发育、循环肿瘤细胞等重要领域有着的应用价值。
  单细胞蛋白质组学的目的就是为了实现对单个细胞内蛋白质组成的定性和定量分析,从而获得不同细胞个体蛋白组的定性和定量差异,构建精细蛋白分子图谱,从根本上揭示不同细胞个体之间的类型及其状态的差异,使科研工作者可以更好地了解细胞及其表型和生命活动。

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