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端粒长度检测

更新时间:2022-12-29

简要描述:

端粒长度检测(telomere)是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构,是一段DNA序列与蛋白质形成的复合体,使正常染色体端部间不发生融合,保证每条染色体的完整性,控制细胞生长与分裂周期,并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。

  端粒长度检测(telomere)是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构,是一段DNA序列与蛋白质形成的复合体,使正常染色体端部间不发生融合,保证每条染色体的完整性,控制细胞生长与分裂周期,并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。人类的端粒重复序列DNA由重复排列的TTAGGG组成(见右图)。

  正常人细胞在分裂过程中,DNA的复制不能够复制其最末端的一小段序列,导致细胞每次分裂后,DNA就会缩短一些,此即“染色体末端缩隐“。由于DNA末端有端粒序列的保护,DNA复制只损失了一部分端粒序列,而不会危及正常DNA序列。当细胞复制多次,端粒缩短到一定程度时,正常DNA序列会变得不稳定,此时,细胞也就开始走向衰老与死亡。研究表明,正常情况下,人体细胞在平均分裂复制50次左右后会因自产毒素而坏死,此即为“海夫利克极限”。
   端粒长度检测是真核生物线性染色体末端的非编码串联重复性(TTAGGG)n阵列,端粒长度的变化,与衰老、癌症、或神经退行性等多种疾病相关。定量PCR法是检测端粒长度的经典技术,用时短,操作简单,结果准确,适用于批量样本检测。
  本产品试剂盒采用双色荧光 qPCR(SYRBgreen+VIC)检测端粒相对长度,检测对象为血液、口腔拭子或细胞DNA。该试剂盒具有以下特点。
  1. 稳定:全程闭管操作,无交叉污染。
  2. 可靠:端粒与内参单管检测,减少孔间干扰。
  内参基因为多拷贝,与端粒量差降低。
  3. 方便:操作简单,无需电泳步骤。
  4. 定量: △CT 值,可定量检测端粒相对长度。
  端粒长度检测是一种相对简单的检测,不需要大量起始 DNA(约 50 ng)。通过测量端粒信号 ( T ) 与参考单拷贝基因信号 ( S ),计算T / S比率,该比率与平均 TL (Telomere Length,端粒长度)成正比,因此可用于确定相对 TL。由于该技术的性质可以应用于高通量检测,因此被广泛用于大规模人群研究。然而,由于 Q-PCR 仅提供相对定量,因此数据通常不会以kb形式的绝对端粒长度呈现,除非与具有由另一种方法确定的平均 TL 的参考细胞系进行比较。有研究显示此方法的测定结果的变异系数可能高于 10% 。而且,由于使用了不同的单拷贝基因,不同实验室之间的结果可能存在很大差异。此外,Q-PCR 不提供有关最短端粒的信息。最后,用于 TL 测量的 Q-PCR 可能不适用于癌症研究,其中的内参单拷贝基因可能由于非整倍性而被复制或丢失。因此,Q-PCR 的适用性仅限于正常二倍体和核型稳定的样品。
  端粒是在所有脊椎动物线性染色体末端的非编码串联重复性(TTAGGG)n序列。端粒的3'末端单链悬垂侵入双链 DNA,形成 T 环,这也导致链位移,产生单链端粒D-环。T 环是端粒的特殊结构,其与端粒保护蛋白Shelterin复合体直接或间接结合,保护染色体末端不被识别为 DNA 双链断裂。
  端粒是真核细胞染色体末端由重复性的dna序列和特殊的端粒结合蛋白所组成的一段特殊结构,其中脊椎动物的端粒由富含g的短双链重复序列ttaggg串联组成。端粒能够防止染色体末端的降解、融合和重排,从而维持染色体的独立性、完整性和稳定性。虽然端粒不具备编码功能,却被科学家称为“生命的时钟”,因为端粒的长度和稳定性控制着细胞的寿命,并与细胞的癌变和衰老密切相关。
  在正常人类体细胞中,端粒的长度会随着细胞分裂而逐渐缩短,细胞每分裂一次,端粒长度缩短一截,损失20~30个核苷酸,当端粒缩短到一定程度时,会诱导核蛋白结构的缺失,触发复制性衰老,出现细胞增殖减慢、生长停滞、干性减退、丧失分化能力等现象。同时,缩短的端粒上某些端粒特殊结合蛋白的丢失还会导致细胞将端粒末端错误识别为dna断裂位点,从而启动dna修复功能,导致短端粒染色体之间的末端融合,染色体的融合会造成细胞有丝分裂异常,细胞周期停滞,进而引发由p53蛋白诱导的细胞凋亡。
  此外,p53等基因突变导致细胞周期检测点缺陷的细胞会跃过复制性衰老,持续分裂最终进入危机期,这个时期极少数细胞表达端粒酶,激活端粒酶活性,修复并维持细胞端粒长度,使得细胞永生化为癌细胞。在诸如直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等90%癌细胞中发现端粒过度缩短和端粒酶活性。端粒异常导致的疾病还包括白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常和先天性角化不良等。端粒在人类的衰老与疾病的发生进程中扮演着极其重要的角色,端粒重复序列的长度变化决定着细胞的命运,因此端粒长度检测是端粒生物学研究中的重要实验方法。
  此外,端粒长度检测在衰老疾病和肿瘤中也具有重要的诊断价值。由于种属差异,人类染色体的端粒长度(双链区长度一般在0.5~20kb)远小于大多数实验室模型生物;且不同个体不同细胞中的端粒缩短程度不一样,细胞内不同染色体的端粒缩短程度也不一样;而长度小于等于3kb的端粒被定义为短端粒,最短的端粒而非平均端粒长度在端粒功能丧失,诱发dna损伤和限制细胞存活中扮演重要角色。因此,亟需一种能够在单个染色体水平精确、简单、快速、高通量地检测人类端粒长度和短端粒比率的方法。
  在端粒相关遗传疾病的发展过程中,当端粒较短时会导致疾病早发 。随着研究的不断深入,人们也越来越认识到生活方式因素,如肥胖、吸烟、缺乏运动和慢性压力等会影响循环外周血白细胞中的端粒长度。另外,导致端粒功能障碍的端粒缩短与许多年龄相关疾病有关,如不孕症、关节炎、糖尿病、癌症、心血管和神经退行性疾病等。因此,可以预测这些疾病发生的稳定且可重复的端粒长度测定方法是十分重要的。
  然而,基本上所有已发表的端粒相关疾病的大规模人群研究本质上都是相关性研究,只提供了端粒平均长度或相对端粒长度的信息。有大量证据表明,触发 DNA 损伤反应的是最短的端粒,从而导致哺乳动物的复制性衰老。最短端粒的长度是决定细胞命运和衰老开始的关键生物标志物,但可检测短端粒的方法却费时费力,不能实现高通量要求。故现有的端粒长度测定方法不分优劣,各有千秋。
  端粒长度的异常改变或许在疾病早期便会发生,端粒长度在几十年后可能会成为某些疾病的早期筛查指标,甚至辅助诊断指标或者预后评估指标。简单易行的高通量检测方法可以用于大规模人群的流行病学研究找到端粒相关疾病,提供不同端粒长度分布的更精确的检测方法可以用于寻找端粒长度与相关疾病之间的可能机制;当然,既高通量又精确又可提供多方面信息的端粒检测方法更应成为我们研究的目标。

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