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流式细胞凋亡检测服务

更新时间:2022-10-13

简要描述:

流式细胞凋亡检测服务与tunel细胞凋亡检测服务实验步骤相近,因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素(如FITC、PE)或生物素(Biotin)标记,以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针,利用流式细胞凋亡检测或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

   tunel流式细胞凋亡检测服务通常称为细胞程序性死亡,是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现,细胞凋亡与多种疾病密切相关,如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力,利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断,疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。
  TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况,其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的链霉亲和素streptavidin特异性结合,后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应,特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3‘-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
tunel流式细胞凋亡检测服务(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织,只要经过一步染色反应,洗涤后就可以通过荧光显微镜或tunel流式细胞凋亡检测服务检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。
  细胞凋亡(apoptosis)是一件主动性细胞死亡事件,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控,是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。具体表现为:出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割,凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等.
  细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时
  抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP),从而可以通过荧光显微镜或tunel流式细胞凋亡检测服务进行检测,这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。注:FITC是fluorescein isothiocyanate的缩写,实际上大多数情况下所谓的FITC即为fluorescein。
  有如下优点:
  (1)高灵敏度:背景染色极低,阳性染色明亮,可以在单细胞水平检测到细胞凋亡,同时由于凋亡早期就有DNA断裂,可以检测到早期的细胞凋亡。
  (2)特异性:TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞,而不容易标记坏死细胞。
  (3)快速:仅需约1-2个小时即可完成。
  (4)方便:只需一步染色反应,洗涤后即可观察,不必使用二抗等进行多步操作。
  (5)应用范围广:可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况,也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
  TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂,但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开,另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
  极少数细胞凋亡时没有DNA断裂,此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下,同时检测多个凋亡指标。
  细胞凋亡或称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death ,PCD)是细胞的生命现象之一,它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关,自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine, PS)位于细胞膜的内侧,但在凋亡的细胞,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素(如FITC、PE)或生物素(Biotin)标记,以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针,利用流式细胞凋亡检测服务或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
  流式细胞凋亡检测服务与流式细胞凋亡检测服务实验步骤相近:
  1.  凋亡细胞的制备
  小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg体重,10 h后解剖取胸腺,分离胸腺细胞。用PBS洗两遍,调整待测细胞的浓度为2×106 /ml,备用。
  2.  200 μl细胞悬液加入1 ml冷PBS,轻轻震荡使细胞悬浮,1000 rpm 4 ℃离心10 分钟,弃上清。
  3.  重复步骤2两次。
  4.  将细胞重悬于200 μl 标记缓冲液。
  流式细胞凋亡检测服务和流式细胞凋亡检测服务注意事项:
  1.  整个操作过程动作要尽量轻柔,切勿用力吹打细胞,尽量在4 ℃下操作。
  2.  反应完毕后要尽快检测,因为细胞凋亡是一个动态的过程,反应一小时后荧光强度就开始衰变。
  3.  Annexin V-FITC是光敏物质,在操作时要注意避光。
  流式细胞凋亡检测服务如何避免出现假阳性结果?细胞接种不易过密:接种对数生长期的细胞时密度不要>1*106,以免细胞培养过程中自身引起凋亡,而非外界处理因素;
  避免消化过度:因消化过度可能会造成PS外翻,得到假阳性的结果。因此消化时最好用低浓度胰酶消化,轻柔吹打贴壁细胞2-3次,尽量把胰酶造成损伤可以控制在5%以内,加上对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响;
  操作尽量轻柔:收集细胞时力度过大很可能造成细胞膜损伤,导致细胞膜的磷脂层暴露,从而结合Annexin V,导致假阳性,因此处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤。
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