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外泌体western鉴定

更新时间:2021-12-17

简要描述:

外泌体western鉴定主要检测指标为CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等,针对外泌体的定性检测,至少选择2-3个指标就能满足文章发表就可以。大部分文献中没有检测内参,个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测,外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低,可能会检测不到任何条带或者条带微弱。

   外泌体western鉴定主要检测指标为CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等,针对外泌体的定性检测,至少选择2-3个指标就能满足文章发表就可以。大部分文献中没有检测内参,个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测,外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低,可能会检测不到任何条带或者条带微弱。
  外泌体western鉴定操作步骤大致是:
  用PBS重悬提取的外泌体,滴于孔径2 nm的载样铜网上,室温静置2 min,用滤纸从滤网侧边吸干液体,用3%磷钨酸溶液在室温下负染5 min,滤纸吸干负染液,室温晾干,电镜观察拍照。外泌体在电镜下具有非常明显的膜边界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯状结构(也会有200 nm以下、较难鉴别的其他形状的外泌体),但电镜对样品的预处理和制备要求较高,样品分离方法和样品性质可能影响电镜结果的好坏;样品的准备阶段比较复杂,不适合对外泌体进行大量快速的测量;且因外泌体经过了预处理和制备过程,无法准确测量。
  扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)或透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)等电子显微镜可用于外泌体鉴定。SEM的工作原理是用能量为1~30 KV间的电子束,以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上,利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成像,获得试样表面微观组织结构和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技术的发展,场发射电子枪的应用得到普及,现代先进的SEM的分辨率已经达到1 nm左右,足够用来进行外泌体尺寸的测量。TEM是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上,电子与样品中的原子碰撞而改变方向,从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关,因此可以形成明暗不同的影像,影像放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、感光耦合组件)上显示出来。
  以上两种方法是常用的外泌体的鉴定方法,是展开外泌体功能研究的前提。比如在肿瘤研究中,通过提取鉴定不同细胞系中的外泌体,进而通过PCR以及测序筛选分析RNA,探究外泌体在肿瘤进展或者耐药中的发生机制。
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