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生物样品扫描电镜

更新时间:2022-06-16

简要描述:

生物样品扫描电镜常规扫描电镜对样品要求:必须是干燥的,不含水分或挥发性物质;具有一定机械强度,能耐受电子束轰击;具有导电性,被激发时能够产生足够的二次电子。生物材料特点:含水分多,质地柔软,机械强度小;组成元素的原子序数低,导电性差,激发后二次电子的产额较少。制样的任务:通过一系列处理,既要尽量地保存材料的固有形态,又要改良其物理性能,使其适合在电镜下观察成像。

    生物样品扫描电镜简称为扫描电镜,英文缩写SEM(Scanning Electron Microscope)。它是用细聚焦的电子束轰击样品表面,通过电子与样品相互作用产生的二次电子、背散射电子等对样品表面或断口形貌进行观察和分析。SEM已广泛应用于材料、冶金、矿物、生物学领域。

  通常人眼能够分辨的最小距离为0.2MM,为了观察分析更微小的细节,人们发明了各种观察仪器。

  首先出现的是光学显微镜,它利用可见光作为照明束照射样品,再将照明束与样品的作用结果由成像放大系统处理,构成适合人眼观察的放大像。一般而言光学显微镜能分辨的最小距离约为200um,是人眼的一千倍。

  为突破光学显微镜的分辨极限,人们想到用电子束做照明束,并与上个世纪三十年代制造出了第一台扫描电子显微镜。它的分辨率已经达到了原子水平(≈0.1um),比光学显微镜提高了近两千倍。

  扫描电子显微镜组成部分

  电子光学系统

  组成:电子枪、电磁透镜、扫描线圈和样品室等部件。

  作用:获得扫描电子束、作为产生物理信号的激发源。

  信号收集和显示系统

  信号收集:二次电子和背散射电子收集器、吸收电子显示器、X射线检测器(波谱仪和能谱仪)

  显示系统:显示屏有两个,一个用于观察,一个用于记录照相。

  扫描电子显微镜的应用

  扫描电镜观察纳米材料

  所谓纳米材料就是指组成材料的颗粒或微晶尺寸在0.1-100nm范围内,扫描电镜的一个重要特点就是具有很高的分辨率。现已广泛用于观察纳米材料。

  扫描电镜观察材料断口

  扫描电镜所显示的断口形貌从深层次,高景深的角度呈现材料断裂的本质,在教学、科研和生产中,有不可替代的作用,在材料断裂原因的分析、事故原因的分析已经工艺合理性的判定等方面是一个强有力的手段。

  扫描电镜观察大试样的原始表面

  扫描电镜能够直接观察直径100mm,高50mm,或更大尺寸的试样,对试样的形状没有任何限制,粗糙表面也能观察,这便免除了制备样品的麻烦,而且能真实观察试样本身物质成分不同的衬度(背反射电子象)。

      生物样品扫描电镜常规扫描电镜对样品要求:必须是干燥的,不含水分或挥发性物质;具有一定机械强度,能耐受电子束轰击;具有导电性,被激发时能够产生足够的二次电子。生物材料特点:含水分多,质地柔软,机械强度小;组成元素的原子序数低,导电性差,激发后二次电子的产额较少。制样的任务:通过一系列处理,既要尽量地保存材料的固有形态,又要改良其物理性能,使其适合在电镜下观察成像。

       电镜是进行材料表征时用到一种重要工具,帮助观察材料的微观形貌。然而,在观察软/湿生物材料时(离体组织,带细胞材料等),涉及到观察样品的固定、脱水、干燥、金属溅射等步骤,处理复杂,耗时较长。

冷冻的水凝胶观察

生物样品扫描电镜的构成:

  主要四大系统:电子光学系统、信号收集及显示系统、真空系统和电源系统。
  (1) 电子光学体系:主要包括电子枪、电磁透镜、扫描线圈和样品室等部件。
  电磁透镜:聚焦电子枪束斑,束斑越小,成像单元越小,分辨率越高。
  扫描线圈:使电子束偏转,在样品上做光栅状扫描,激发多种电子信号。

  样品室:放置样品,并安装有各种信号探测器。

  (2)信号收集及显示系统:收集样品在入射电子束作用下产生的各种信号,二次电子、背散射电子、特征X射线等,并进行放大转换显示在显示系统上像。

  (3)真空系统:场发射电子显微镜的电子枪需要高真空度,所以配有2台离子泵,1台分子泵和一台机械抽空泵。

  (4)电源系统:包括启动的各种电源,检测-放大系统,真空系统和成像系统等。

  分辨率的下降,扫描样品在干燥过程中,由于失去水分会造成组织和细胞结构发生皱缩。此外,液体巨大的表面张力,将对细胞超微结构产生严重的影响。因此,生物样品的干燥是扫描制备中的关键。样品观察表面必须具有良好的导电性和较高的二次电子发射率

        生物样品扫描电镜扫描图像的质量与样品受激发产生的二次电子的多少有很大的关系。对于一幅由10°个像素组成的图像,生物样品扫描电镜扫描探针在样品的每个扫描点上要产生平均6个二次电子,对于生物样品,一般只能产生0.1~2个二次电子,使得图像的质量与分辨率均受到影响。另一方面由于生物样品的导电性较差,入射电子在样品表面堆积,容易形成充放电现象,造成忽亮忽暗、全黑全白、图像错位等反常图像。因此,提高样品的导电性、消除充放电效应和增强二次电子发射率是生物样品扫描制备的另一个基本要求。

 低真空下电镜观察叶子气孔

  是在真空状态下观察样品的表面形态。而生物样品主要特点是含水量多,脱水干燥过程中容易收缩变形;大多数生物组织由碳、氢、氧、磷、钾等原子序数较低的元素组成,不易激发二次电子,导电性较差。因此制备的样品要求满足以下条件。
  1.样品观察表面必须真实

  样品观察表面必须保持其在活休状态时的形貌。在样品处理中要去掉覆盖在表面的灰尘、粘液、蜡质等杂质。此外,取样时避免机械损伤。

  2.样品必须干燥且不变形

  含水的生物样品在真空条件下极易挥发,因此,在扫描观察时样品必须干燥,以防水分的蒸发影响仪器的真空度

  注意事项:
  1.细菌和真菌的处理方法与细胞一样,但固定时间需延长(几小时甚至过夜);

       2.在样品制备的过程中应始终保持样品湿润,切勿让样品干裂;

       3.由于扫描电镜观察样品表面,因此一定要冲洗干净样品表面的残余杂质;

       4.较大样品需将样品切成片状,厚度不超过2-3mm。

  一、取样:

  选取观察材料需根据材料的特性与观察目的的不同,采取不同的方法。取样的基本要求:取材动作迅速;取材部位准确;固定及时;避免机械损伤。体积的大小没有太大的限制,观察表面的面积通常不超过10mm×10mm,厚度约儿个毫米。对于一些微小的单体材料(如游离细胞、细菌、线虫等),取样时应注意材料数量要取够,防止在制备过程中由于丢失造成材料不足而影响观察。对于样品断裂面的获取最好采用冷冻断裂的方法。

  二、清洗:
  样品的清洗主要有二个作用。其一是用清洗液除去样品观察表面的杂质或异物,其二是用缓冲液清洗掉没有与样品结合的固定剂。

  用清洗液清洗去除样品表面的灰尘、粘液、油脂、蜡质等,可使样品表面充分暴露。清洗液有双蒸水、生理盐水、含酶的清洗液、各种缓冲液、有机溶剂等。清洗的方法可采用气吹、冲洗、刷洗、超声波清洗等方法。清洗过程中要避免对样品表面细微结构损伤。清洗的具体做法可根据研究l的、样品性质和样品对环境变化的敏感程度选用不同的清洗液和清洗方法。

  三、固定
  固定的目的是利用固定剂保存样品细胞内的各种成分和结构,使它尽可能接近活体状态。固定的方法的是戊二醛——饿酸双固定,其中饿酸固定还具有增加组织的导电性的作用。对一些观察倍数要求不是很高的材料,可只用戊二醛单固定。对一些形态结构不易发生变化的材料(如种子、某些花粉、孢子等),甚至可以不用固定。固体培养基上培养的真菌、菌丝之类的材料,可用饿酸蒸气薰蒸加以固定。培养细菌的菌毛在取样之前,可先加入戊二醛固定。

  固定剂的种类、配制方法、固定时间和操作条件及要求与透射电镜样品固定处理基木相同。

  四、脱水

  扫描电镜样品脱水的目的是用脱水剂取代样品中的游离水,为了使样品在干燥过程中,避免样品中水分直接蒸发时产生巨大的表面张力(水的表面张力在20℃时达46000kg/cm3),使样品结构遭到损伤。常用的脱水剂是乙醇和丙酮,采用等梯度系列脱水的方法,脱水时间间隔5~15分钟。在100%脱水剂中要过2~3次。

螨虫自然风干电镜直接观察

选择电镜
  1、如果需要研究样品的内部结构,例如细胞器的改变,则应选择透射电镜观察  

       2、如果需要研究样品表面的形态结构,如细胞的外形、细胞的生长形态等,则应选择扫描电镜观察

生物样品取材、固定、保存

  1、透射电镜样品: 

1) “快速”:指尽量在活体条件下取材或动物断血后2分钟内取材,并迅速将组织放入电镜专用3.5%戊二醛固定液内(不可用酒精或消毒级戊二醛固定),并于4℃冰箱内保存,切忌样品结冰。 

2) “准确”:指取材部位要准确。取材的器械要锋利,尽量减少对组织的牵拉和挤压。 

3) “体积小、低温”:指组织厚度不应大于3mm,取材温度最好控制在4℃左右进行操作。

  2、扫描电镜样品

1) 取材时还应尽量保护观察面,避免用镊子夹持观察区域,在固定前,通常应用适当的清洗液清洗样品表面的杂质,灰尘,粘液等附着物。

2) 常用的清洗波有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液或含酶的清洗液。

3) 样品取好后,放入3.5%戊二醛固定液内固定,保存在4℃冰箱中,切忌样品结冰。

流程

  1、透射电镜

取样——3.5%戊二醛前固定;1%鐵酸后固定——酒精、丙酮逐级梯度脱水——Epon-618渗透、包理——半薄切片——光镜选区定位——修块——超薄切片机切片——柠檬酸铅、醋酸铀双染色——透射电镜观察——摄片——分析+报告

  2、扫描电镜样品

1) 取材——清洗——固定——冷冻——SEM观察(冷冻电镜)

2) 取材——清洗——固定——脱水——干燥——镀膜——SEM观察(常规检测)

3) 取材——清洗——固定——组织导电处理——脱水——SEM观察(特殊样品,例如外泌体)

花粉烘干喷金二次电子观察
 

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