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miRNA荧光定量检测服务

更新时间:2022-06-16

简要描述:

miRNA荧光定量检测服务( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。可用于mRNA、microRNA、lncRNA等基因表达量的检测。

  miRNA荧光定量检测服务( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。可用于mRNA、microRNA、lncRNA等基因表达量的检测。

 

miRNA荧光定量检测服务常有两种检测方法

  1)探针法

  PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

 

  2)miRNA荧光定量检测服务染料嵌入法

  使用荧光染料SYBR或EVGreen。荧光染料可以结合到双链DNA上面,当体系中的模板被扩增时,荧光染料可以有效结合到新合成的双链上面,随着PCR的进行,结合的荧光染料越来越多,被仪器检测到的荧光信号越来越强,从而达到定量的目的。

 

miRNA荧光定量检测服务
  1)引物设计
  2)RNA提取
  3)RNA逆转录合成cDNA
  4)real time PCR 反应

  5)数据分析

 

miRNA荧光定量检测服务结果
  基因表达量变化的直方图、热图等,miRNA荧光定量检测服务是功能研究的基础,锁定关键目标,找到深入研究的方向对研究至关重要。

  是一类长度约19-24nt的非编码单链RNA,通过碱基互补配对的方式与靶基因的3’-UTR区部分或完全互补,剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译,从而起到转录后调控靶基因表达的作用。它广泛存在于动物、植物、真菌及病毒的基因组中,调控生物体生长发育和疾病发生等过程中相关基因的表达。miRNA的异常表达可能会导致生理状态的异常和疾病的产生,在多种癌症中,miRNA的表达水平会发生明显改变,有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外,在许多其他的病变组织和细胞中也检测到了miRNA的异常表达。因此对miRNA的表达的研究具有重要意义。

  1)样品提供
  a.RNA样品:取适量新鲜组织,匀浆后抽提总RNA,并提供RNA质量检测图。
  b.组织样品:取适量(50-100mg)液氮保存的组织。
  c.血液样品:加凝固剂并离心,取血清、血浆或全血进行分析。
  d.细胞样品:取107个细胞,吸去培养液后用TRIZOL试剂抽提RNA。

  提供实验报告、详细的实验方法、实时荧光定量PCR实验结果、图表及相关分析数据。

 

miRNA荧光定量检测服务中的miRNA是如何产生的?

  miRNAs 是转录后长片段的 RNA 分子( pri-miRNA )的一部分,首先在细胞核内被双链 RNA 特异的核酸酶Drosha 处理成为 70-100 个核苷酸组成的发夹结构 RNA ( pre-miRNA )。这一发夹结构 RNA 运输到细胞质,被另一个双链 RNA 特异的核酸酶 Dicer 剪切,得到 19-23 个 核苷酸组成的成熟的 miRNA ,结合在与 RNA 介导的沉默复合物( RISC )类似或者相同的复合物中,这个复合物参与了 RNA 干扰。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的碱基配对引导 RISC 降解目的片段或是阻碍其翻译过程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互补的碱基配对决定了这个过程的特异性。通过抑制翻译还是降解发挥作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之间的错配程度决定的,匹配程度高的目的 mRNA 将被降解。由于 miRNAs 可以对不完全互补的 mRNA 配对来抑制蛋白质的翻译过程,因而每个 miRNA 可以有多个靶基因,而几个 miRNAs 可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个 miRNA 来经济地调控多个基因的表达,也可以通过几个 miRNAs 的组合来精细调控某个基因的表达。对于基于 miRNA 调控基因表达的研究的逐步深入,将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。

 

miRNA荧光定量检测服务基本原理

  实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂,利用荧光信号实时检测PCR进程,zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地定量起始模板浓度。但是就成熟的microRNA而言,由于其是由21-25个核苷酸组成的小RNA,长度太短,并不能通过传统的实时定量PCR进行检测,但是通过特殊设计的茎环结构的反转录引物,配合实时定量PCR引物及探针可以检测微量样品中microRNA表达水平,也可以用终点PCR法定性检测。

 

  虽然 microRNA 实时定量PCR是一种zui近才发展起来的检测技术,其技术细节还在不断完善中,但是microRNA 实时定量PCR检测系统,相对其它microRNA检测技术有以下优点:
  1.高特异性 , 可以只对成熟 microRNA 进行定量,有效区分成熟 microRNA 分子和前体分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子;
  2.快速,简单,省时,整个操作只需两步,不到 3 个小时,即可获得高质量的数据;
  3.检测灵敏度高,样品消耗少,仅需 1-10ng 的总 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ;

  4.超宽的线性范围,可跨越 7 个数量级;

 

样品保存及运输

加入有RNAsolidTM试剂的样本可在37℃保存1~2天,2天以后部分组织中的RNA会开始降解。室温(25℃)稳定保存1周,不会有明显的RNA降解发生。大部分样品置于RNAsolidTM试剂中,4℃条件下可稳定保存1个月,不会有明显的RNA降解发生。长期存放可先将保存在RNAsolidTM试剂中的样本4℃浸透过夜,然后将RNAsolidTM试剂吸出弃去,再将样本放入-20℃或-80℃长期稳定保存3~5年。

 

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