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组织石蜡切片的操作步骤及注意事项
发布时间:2022-07-18   点击次数:69次
   石蜡切片是最基本的切片技术,冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。
  详细操作步骤:
  A 材料预处理:材料切割成适当大小总体积不超过1cm?,例如叶片切成边长3mm~5mm的方块,放入带塞小瓶或离心管48h以上。(瓶中事先装入适量F.P.A.固定液,要淹没材料,若是材料浮在液面上,可用棉花将材料压到液面下。)
  B 梯度酒精脱水:根和茎:50% 3h,70%2h,85%1h,95% 30min,无水乙醇30min。(叶片:50% 3h,70% 12h,85% 1h,95% 1h,无水乙醇1h。)
  C 透明:根和茎:纯二甲苯/无水乙醇=1:1(V:V)处理2h,纯二甲苯处理1h。(叶片:酒精:二甲苯=1:2处理1h,酒精:二甲苯=1:1处理1h,纯二甲苯处理1.5h,于30℃,70r/min的摇床中)(浸到组织块透明,若不透明,则纯二甲苯再处理1次;材料若是变脆的话,可在透明步骤适当减少透明时间)。
  D 浸蜡:根和茎:将上述材料连同纯二甲苯一起转入两倍体积的纯石蜡溶液中,放置于55℃烘箱中24h,使石蜡不凝固沉淀即可。之后将材料用镊子轻轻夹起放入纯石蜡中继续浸蜡24h。(叶片:25%石蜡60℃ 1h,50%石蜡60℃ 1h,75%石蜡60℃ 1h,纯石蜡60℃ 10h)
  E 包埋:将浸好的材料转移到已溶解的纯石蜡中进行包埋。包埋时有专门的包埋模具,先将熔化的纯石蜡倒入模具中,石蜡适当溢出模具中央的槽子,以便于后期取蜡块;之后用酒精灯已烧热的镊子先在浸有材料的石蜡溶液的冷却一下,之后再将材料夹到包埋槽中进行包埋;随后将包埋槽置于4℃左右的冰水中迅速冷却,若出现裂纹,此时就需要重新包埋,步骤同上。
  F 修蜡:将包埋有材料的蜡块多余部分切掉即可。
  G 切片:将蜡块固定在蜡座上,将蜡块放在蜡座上,用手稍微固定,再用酒精灯烧热的镊子沿着蜡块周围熔化石蜡,之后等石蜡冷却即可将蜡块固定在蜡座上。调整好切片厚度(根茎25um;叶≥95um(叶片包埋的方法不同于其他);肉质根及侧根切片厚度12um。)与刀片角度(6°~8°)即可切片,完整的切片应该是材料在单个蜡片上,不能有褶皱。
  H 贴片与捞片:在干净的载玻片上涂上一层薄的明胶黏贴剂,一般40℃烘箱过夜。将蜡条置于40℃蒸馏水中捞片,之后同样置于40℃烘箱过夜。明胶黏贴剂配方:明胶1g,苯酚2g,蒸馏水100ml,丙三醇15ml。配法:明胶和蒸馏水一起倒入烧杯中加热,明胶熔了即可停止加热,之后再加2g苯酚和15ml丙三醇,搅拌至全溶,纱布过滤,贮存于有盖瓶中备用。
  I 去蜡:纯二甲苯20min,纯二甲苯/无水乙醇=1:1(V:V)10min,纯二甲苯/无水乙醇=1:2(V:V)5min。
  复水-番红染色-复水-固绿染色-封片:纯酒精30s,95%酒精30s,85%酒精30s,70%酒精30s,60%酒精15s,1%番红染色12~24h,70%酒精15s,85%酒精15s,固绿染色30s ,95%酒精15s,纯酒精15s,酒精:二甲苯=2:1处理2min,酒精:二甲苯=1:1处理2min,纯二甲苯5min,最后中性树胶封片
  注意事项:
  1%番红染液配方:番红1g,≥50%酒精100ml,定量滤纸过滤备用/其实质量好的番红不过滤直接用也行。
  0.1%固绿染液配方:固绿0.1g,95%酒精100ml,定量滤纸过滤备用/其实质量好的番红不过滤直接用也行。
  脱水与固绿染色:50%酒精20~30s(此时换用稍大一些的烧杯,番红染色的载玻片上沾有大量翻红酒液,此时可在大烧杯中洗去载玻片上多余的染色液,以免后续酒精溶液被染色),70酒精20~30s,85酒精20~30s,95%酒精固绿染色10~15s,95%酒精20~30s(此时95%酒精也可用大一些的烧杯重新配,以便洗去载玻片上多余固绿染液),纯酒精20~30s。(材料在高酒精浓度中浸泡时间不宜过长,以免使材料过度脱水造成组织结构变形)
  封片:在载玻片上的材料处滴加适量中性树胶,再盖上盖玻片封片,自然烘干即可显微观察。(盖盖玻片时,先将盖玻片一边固定,对边缓缓下降,可减少气泡产生)。

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