一、生物样品扫描电镜具体步骤
样品准备
取材:根据研究目的准确取材,确保样品具有代表性且体积不宜过大,一般不超过8mm×8mm,厚度不超过5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等,需固定在滤纸或卡片纸上以充分暴露待观察的表面。
固定:样品需进行双固定处理,先用1%-3%的戊二醛/缓冲液在室温或4°C下前固定,时间根据样品特性而定。随后用1%饿酸/缓冲液在4°C下进一步固定。固定过程旨在保持样品的形态和结构。
清洗:对于表面凹凸不平或有杂质的样品,在固定前后需进行清洗,以去除杂质,避免影响成像质量。
脱水与置换
逐级脱水:样品需经系列浓度的乙醇或丙酮逐级脱水,一般从30%、50%、70%、80%、95%至100%,每步处理10-15分钟。
置换:用乙酸异戊酯置换100%乙醇,室温下放置20分钟以上,以减少样品在干燥过程中的收缩和变形。
干燥
干燥方法多样,包括临界点干燥、空气干燥、化学药品干燥和冷冻干燥等。干燥过程需确保样品表面形貌不被破坏,且样品需干燥无水、无易挥发溶剂,以避免对电镜造成损伤。
导电处理
喷涂导电膜:在真空条件下,对样品表面喷涂10-20nm厚的金或铝膜,以增强样品的导电性,确保电子束能顺利释放二次电子,从而改善图像的亮度和反差。
上镜观察
将处理好的样品放置在扫描电镜的样品台上,调整样品高度至距电子枪既定距离(一般约10mm)。
启动扫描电镜,设置加速电压、放大倍数、扫描速度等参数,通过控制器和电脑对样品进行观察,获取样品的形貌和结构信息。
二、检定过程中需要注意的事项
样品准备质量
确保样品制备过程中的每一步都精细操作,避免对样品造成机械损伤或化学污染。
固定、清洗、脱水和干燥等步骤需严格控制时间和条件,以保证样品的形态和结构不被破坏。
电镜操作环境
保持操作环境清洁无尘、无震动、无电磁干扰,以保证扫描电镜的稳定性和准确性。
定期清洁和维护电镜设备,确保其长期稳定运行。
参数设置与校准
根据样品的特性和观察需求合理设置扫描电镜的参数,如加速电压、放大倍数等,以获得最佳的图像质量和分辨率。
在观察前进行必要的校准操作,如调整电子束的扫描速度和扫描模式等,以确保图像的准确性和稳定性。
样品导电性
对于非导电样品,喷涂导电膜是一步。导电膜的厚度需适中,既能改善图像质量又不掩盖样品结构。
对于某些无法喷镀导电膜的样品,可采用低真空模式观察以缓解荷电效应。
安全注意事项
在操作过程中佩戴干净无粉手套,避免直接接触样品和设备以减少污染。
注意个人防护措施,避免长时间暴露在电子束辐射下。
遵守实验室安全规程,确保设备和人员的安全。
综上所述,生物样品扫描电镜技术涉及多个精细步骤和注意事项。只有严格按照操作规范进行样品准备和检定过程,才能获得高质量的观察结果并确保电镜设备的长期稳定运行。随着技术的不断进步和应用领域的扩展,扫描电镜将在生命科学研究中发挥更加重要的作用。