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免疫组化实验要点
发布时间:2019-05-30   点击次数:966次

 

样本来源   

对于IHC,组织是来自患者或动物,经过冷冻或石蜡包埋。然后切成约4μm厚的切片。对于ICC,大部分细胞外基质被去除,只剩下整个细胞来染色,来源可以是细胞悬液,或组织培养细胞系。

然而IHC远远不止于把抗体放在组织切片上、然后用显微镜观察那么简单。要想得到实用、可靠而清晰的结果,就需要耐心的对每一步进行优化。根据标记物的不同分为免疫荧光法和免疫酶法,R&DSystems的网站列出了IHC/ICC实验设计和优化的变量及影响因素如下:

样本类型:组织或细胞

样本制备:组织(石蜡或冰冻),细胞:(贴壁细胞或细胞悬液

适当对照:无一抗,组织类型。

固定方法:灌注或浸泡。

固定剂:甲醛,醇类,丙酮。

封闭液:正常血清,牛血清蛋白(BSA)或脱脂奶粉。

抗原修复:蛋白酶,加热。

检测方法:直接或间接

一抗:物种

二抗:物种

标记物:荧光或酶(显色)

复染剂:苏木精或DAPI(荧光)

封片剂:抗淬灭或水性

显微镜观察:荧显微镜或光学显微镜

处理不同样本的区别 

ICC需要透化,要么通过固定过程,要么是单独的透化步骤,而IHC可能不需要单独的透化步骤,这取决于切片的厚度和固定方法。包埋在石蜡中的组织样本在抗体染色前需要进一步处理。一旦处理好样品,IHCICC的染色操作就几乎没什么差异了。

样本固定和制备

组织石蜡包埋前的组织固定:4%甲醛固定剂是组织灌注和浸润固定的常用溶液,一般需要424h,能很好地保留组织形态,切片机切片,贴附于载玻片干燥,石蜡切片存储室温多年,后续进行IHC/ICC之前需要再水化,需要抗原修复。

培养细胞固定:2%甲醛室温固定20min,细胞样本贴附载玻片,对于贴壁细胞直接放在6孔或24孔底部的无菌载玻片上生长,悬浮细胞可通过与包被多聚赖氨酸的载玻片孵育10min而附着在载玻片上。

冰冻组织切片固定:切片后用醇类固定,用于检测磷酸化依赖的表位,在低温箱进行样本切片,冰冻切片存储–80℃多达一年。通常保留酶的活性和抗原功能,不需要抗原修复,冰晶的形成可能负面影响组织结构。

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