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免疫印迹法
发布时间:2019-05-07   点击次数:2094次

Western blot基本原理

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western blot的中文名称是:蛋白质印迹,也叫免疫印迹(immunoblotting)。是分子生物学中常用的三种印迹技术之一。目前*的该实验技术的发明人为美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。

Western blot——蛋白质印迹

Southern blot——DNA印迹

Northern blot——RNA印迹

Western blot 优点

高分辨率的电泳技术

特异敏感的抗原-抗体反应

1-5ng中等大小的靶蛋白

Western blot应用

目的蛋白的表达特性分析

目的蛋白与其它蛋白的互作

目的蛋白的组织定位

目的蛋白的表达量分析

Western blot 流程

一、蛋白样品的提取

提取细胞中的蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。其中裂解液应该新鲜制备,加入少量的蛋白酶抑制剂以减少蛋白的降解,并且分装冻存于-80℃,蛋白酶抑制剂的种类很多,要根据具体情况选择。

目的:要获得高丰度、高品质的蛋白质,以满足后续实验的需求。

二、蛋白样品的定量

Western blot作为一项半定量实验技术,电泳前,必须尽量使各组之间总蛋白量基本一致;

蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力。

目前常用比色法测定样品蛋白的含量:Bradford法(考马斯亮蓝法)、Lowry法(Folin-酚试剂法)、BCA法等。

三、蛋白样品的变性

1M Tris-HCl(pH6.8)

10 ml

1M  DTT

20 ml

SDS

4 g

甘油

20 ml

溴酚蓝

0.2 g

总体积

100ml

全部配好分装,-20℃冻存。

1:1比例与蛋白质样品混合,95100℃加热515min,冰上冷却后再上样,上样量一般为20-25μl,总蛋白量2050μg

SDS

阴离子去污剂   变性剂

氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。

蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,消除了不 同分子之间原有的电荷差异。

与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开,使蛋白质分子线性化。

蛋白质-SDS胶束的特点:

不连续的电泳缓冲体系。

SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时,不再受蛋白质电荷与形状的影响,而只取决于蛋白质分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝胶配制及蛋白分离范围

灌胶
灌制分离胶 隔绝空气 灌制浓缩胶  插入梳子                 

四、电泳

加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品(Marker 5-10ul ;样本:10 ul )。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。

采用恒压的方法:1.恒压60V,至样本跑过 浓缩胶;2.将电压调至120V至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,准备进行进行转膜。

五、转膜

凝胶电泳结束后,将凝胶上分离的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上,常用的固相支持物有NC (硝酸纤维素)膜、尼龙膜及PVDF(聚偏氟乙烯)膜。

选择膜的主要根据有:

1.膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量)

2.膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小)

3.不影响后续的显色检测(也就是适合用于所选显色方法,信噪比好)

4.如果后继实验有其他要求,比如要做蛋白测序或者质谱分析,还要根据不同目的来挑选不同的转移膜

湿转系统

转一张膜需准备滤纸和1张转印膜。切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。转膜前,转印膜以及滤纸均需浸润在电转液中活化15-20min(其中PVDF膜需在无水甲醇中活化30min后再浸润于电转液中,且滤纸应与胶和膜的大小一致)。

将玻板轻轻撬开,将凝胶剪裁后从玻板上移至电转液中。从阴极到正极,按照三层滤纸   凝胶 转印膜 三层滤纸的顺序制成“三明治”(湿转在三明治的两侧各加一层活化过的海绵,同时应注意去除膜、凝胶和滤纸之间的气泡)。

半干转移系统

六、转膜后检测

转完后将膜用1×丽春红染液染5min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白,将膜晾干备用。

将凝胶用考马斯亮蓝染色,观察凝胶中的蛋白是否*转至印迹膜上。

七、封闭,结合一抗,结合二抗。

封闭

为避免作为检测试剂的特异性抗体与膜发生非特异性结合,使非特异性背景提高,需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。

5%脱脂奶粉或BSA(室温孵育1h

Tween-20的作用:减少非特异性吸附,不影响抗体与抗原的结合。

一抗孵育

把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中,根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液,摇床上平缓摇动,于室温孵育1-2小时或4℃过夜。

回收一抗溶液,用TBST漂洗膜3次,每次10min

二抗孵育

加入二抗,摇床上缓慢摇动,于室温孵育1-2小时或4℃过夜。

TBST漂洗膜3次,每次10min

后用TBS漂洗膜2次,每次10min

八、固相免疫检测

利用ECL(增强化学发光)发光检测目的蛋白。

ECL试剂采用氧化还原反应的原理:

发光液AB分别是鲁米诺和过氧化氢,在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物,过氧化物不稳定随即分解,形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态,就会产生荧光。

九、Western blot结果分析

目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差,所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

内参的选择

内参即是内部参照,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。

内参起着校正总蛋白上样量的重要作用,只有在内参条带基本均匀一致的情况下,目的蛋白条带出现的差异才有意义,表明的确是实验设计的干预因素造成目的蛋白量的变化,而不是加样误差造成目的条带含量的变化。

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