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免疫组化原理解析
发布时间:2019-04-28   点击次数:1840次

1、免疫组HE染色对比

免疫组化染色和HE染色的不同之处可能HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变;而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变(数量)、也可检测细胞内细胞因子的转位,组织中一些特异性蛋白的表达的量改变(通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析)

通俗的讲,HE仅仅是看大体病理改变,比如组织坏死,比如炎性渗出。免疫组化,看你的目的蛋白的表达情况

2、免疫组化DAB显色

DABHE一样也是一种染色剂,HE染色相对简单,能分辨出细胞中的嗜酸嗜碱性物质;DAB显色是经过一系列复杂的生化反应,DAB是被过氧化氢在辣根过氧化物酶催化下产生氧气所氧化,形成浅棕色不溶性产物,而定位于过氧化物酶活性的部位。

3、什么叫二抗?

比如羊抗兔(二抗),用兔子的免疫球蛋白注射免疫羊,羊就产生可抗兔子免疫球蛋白FC端的抗体。因此所有羊抗兔可以结合兔子的同种异型抗体,也就是说只要是兔子产生的抗体,羊抗兔(也叫抗抗体或者2抗)都可与之结合。在试验中,二抗经常被打上了标记,比如辣根过氧化物酶,经常被用在ELISAWESTERN等经典的生物学试验中。

4、封闭非特异性蛋白结合位点

封闭的原理:固相载体表面(elisa板,NC膜或者PVDF膜上等)有很多洞洞,通过电转或包被,胶上的蛋白被转移到了膜上,或抗原/抗体固定在板上,蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面,但蛋白并不是连续的,有很多空隙,而且比如说样品孔之间也有空隙,这些洞洞并没有填进东西,而抗体也是蛋白,也会被吸附在空的洞里,这样,就会有很多非特异性的信号。封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合,同样以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上,因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合,所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这样,抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上,而只会跟特异性蛋白结合。封闭剂应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。

封闭所用试剂:主要为血清,血清封闭原理主要有两点:是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质,从而导致背景过高,因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合,从这点看,BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体,可以和抗体恒定区结合,与抗体特异性无关,封闭血清中有抗体,因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。

5、免疫组织化学染色方法

①酶桥法和过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法。

②亲和免疫组织化学法。

酶桥法的基本原理是将酶免疫动物,制备价且特异性强的抗酶抗体.然后用第二抗体作为桥,将抗酶抗体和特异性抗体(即连接在组织抗原上的抗体)连接起来.再将酶结合在抗酶抗体上.经过酶催化底物显色,从而显示出抗原所在的部位及含量

作为桥的第二抗体(即桥抗)必须对特异性抗体(一抗)和抗酶抗体均有特异性,这样才能将两者相连起来.因此,一抗和抗酶抗体应由同一种属动物产生。例如,特异性抗体和抗酶抗体均由兔产生,再用羊抗兔IgG作为桥抗将两者连接起来。

PAP的基本原理与酶桥法相似,均是利用桥抗将酶连接在抗体结合的部位,所不同的是,先将酶(过氧化物酶)和抗酶(过氧化物酶)抗体(PAP)制成复合物,以代替酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶,将两步合并为一步。这一重要的改进,不仅简化了操作步骤,而且大大提高了敏感性。PAP法的不足之处是反应步骤多,需时长,在实际操作中,会带来非特异性放大效应。亲和免疫组织化学结合了免疫酶组织化学在待检抗原部位形成有色沉淀和亲和组织化学能产生有效抗原信号放大系统的特点,使其敏感性大大增加,操作过程省时,背景清晰。因而成为目前应用广的免疫组织化学方法。

亲和免疫组织化学法是从酶桥法和PAP法发展而来,主要有ABC法和SP法。

ABC法(卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法),ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力特性,与生物素化二抗结合,形成抗原+特异性抗体+生物素化二抗+卵白素-生物素-HRP复合物,后DAB显色。复合物配制:先将生物素与酶结合,形成生物素化HRP,以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合,形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。

SP法(抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物),本身没有连接生物素,但有两个生物素亲和力极高的结合位点,可以与二抗上的生物素结合,敏感性高,复合物不需要使用前混合,更为简便。

 

 

 

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